Amonyum Asetat ile DNA İzolasyonu Yöntemi
Amonyum asetat, DNA izolasyonunda özellikle proteinlerin ve diğer hücresel bileşenlerin çöktürülmesi amacıyla kullanılan yaygın bir tuz çözeltisidir. Bu yöntem, organik çözücülerle (fenol-kloroform) birleştirildiğinde etkili ve düşük maliyetli bir DNA saflaştırma tekniği sunar. İşte amonyum asetat kullanarak DNA izolasyonunun temel adımları:
Gerekli Malzemeler
- Hücre veya doku örneği
- Sıvı azot (doku örnekleri için)
- Lizis tamponu (örn: SDS veya Triton X-100 içeren)
- Proteinaz K enzimi
- Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı (25: 24: 1)
- 7.5 M Amonyum asetat çözeltisi
- %70 ve %95'lik etanol
- TE tamponu veya steril distile su
- Santrifüj ve tüpleri
- Mikropipet ve uçları
Adım Adım İzolasyon Protokolü
1. Hücre Lizisi
- Hücre veya doku örneğini uygun lizis tamponu içinde homojenize edin.
- Doku örnekleri için sıvı azotla dondurma ve öğütme işlemi uygulayın.
- Proteinaz K enzimi ekleyerek 55-60°C'de 1-3 saat inkübe edin.
2. Protein Uzaklaştırma
- Fenol-kloroform karışımı ekleyip vorteksleyin.
- 10-15 dakika santrifüjleyerek faz ayrımını sağlayın.
- Üst fazı (DNA içeren) dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
3. DNA Çöktürme
- Üst faza 0.5-1 hacim 7.5 M amonyum asetat ekleyin.
- 2 hacim soğuk %95'lik etanol ekleyip yavaşça karıştırın.
- -20°C'de 30 dakika veya bir gece bekletin.
4. DNA Toplama ve Yıkama
- Yüksek hızda (12,000-14,000 rpm) 15 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatantı dikkatlice atın.
- DNA peletini soğuk %70'lik etanolle yıkayın.
- Kısa süre santrifüjleyip etanolü uzaklaştırın.
5. DNA'nın Çözündürülmesi
- Peleti kurumaya bırakın (havayla veya vakumda).
- TE tamponu veya steril distile suda çözündürün.
Önemli Noktalar
- Amonyum asetat konsantrasyonu kritiktir; çok düşük konsantrasyonlar DNA verimini azaltır.
- RNA kontaminasyonunu önlemek için RNaz A tedavisi uygulanabilir.
- Çöktürme sıcaklığı ve süresi DNA verimini etkiler.
- DNA kalitesi spektrofotometre veya jel elektroforezi ile kontrol edilmelidir.
Avantajlar
- Düşük maliyetli
- Toksik kimyasal kullanımını azaltır
- Orta derecede saflıkta DNA eldesi
Dezavantajlar
- Diğer yöntemlere göre daha uzun süreli
- Fenol gibi toksik maddeler içerebilir
- Çok yüksek saflık gerektiren uygulamalar için uygun olmayabilir
Bu yöntem, rutin moleküler biyoloji uygulamaları için uygun miktarda ve kalitede DNA elde etmek amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. | 
